達(dá)學(xué)堂·答疑討論
Q：凍組織的時候加幾滴水，加以固定，這個方法行嗎？
答：這個沒有試過，原則上講是不行的。
Q：甲狀腺冰凍有時候切片染完上面膠質(zhì)有時候有，有時候沒有，怎么回事呢？
答：95%酒精固定有時膠質(zhì)會脫落。出現(xiàn)這種情況除部分與制片有關(guān)外，與組織本身的結(jié)構(gòu)特點、膠質(zhì)的吸收、濃聚狀態(tài)也有關(guān)。切片也不要太薄。返藍(lán)氨水濃度不要太高，0.2%足夠了。洗片時動作輕柔。
Q：如果科研標(biāo)本取材下來冷凍保存，后期拿出來再切冰凍，怎么處理才能減少冰晶的產(chǎn)生？
答：組織冷凍是動態(tài)的，溫度低于-65度蛋白酶才失活，科研要冷凍組織就要速凍到-70度或液氮。切片時把組織取出來放在冰凍機(jī)里復(fù)溫20分鐘左右就差不多可以切了。
Q：返藍(lán)液ph大于8.2會有什么影響呢？
答：返藍(lán)液一般pH為7.5-9.0，8.2最佳（國外推薦）。我實驗是pH 大于12會掉片。pH太高，如果沖洗不干凈，會影響后續(xù)伊紅染色。
Q：水溶性伊紅染液和醇溶性染液什么更不容易褪色？用于標(biāo)記取材時胃黏膜等小組織一般用什么做標(biāo)記？
答：兩者染色原理有異，水溶性有離子鍵作用，所以加冰醋酸增強(qiáng)染色作用明顯，醇溶性以取代反應(yīng)和靜電為主。處理好的組織，用這兩種伊紅效果都可以。我們不標(biāo)記，要標(biāo)記就得把伊紅放到酒精里，直接打到組織表面或加到固定液都容易褪色。
Q：能講下冰凍免疫組化的固定嗎，哪種固定液最好？
答：國外推薦，靳老師自己過去做免疫熒光都用4度丙酮10分鐘，略揮干后PBS洗，后續(xù)做。要做免疫組化，丙酮并不好，組織收縮比較嚴(yán)重，可用甲醇、AF液，也可以用廠家專門的IHC固定液。
Q：為什么甲狀腺冰凍用速凍了反而切出來一絲一絲的，可能是凍過了，但肉眼觀感覺又沒凍好，該怎么控制速凍時間了？
答：我們講課或做實驗時都是理想狀態(tài)，在實際工作中，不可能給每一類組織設(shè)個專門的溫度，甲狀腺膠質(zhì)含大量線狀糖蛋白，容易玻璃化，大的膠質(zhì)結(jié)節(jié)又沒有間質(zhì)支撐，凍得溫度低于脆點就容易發(fā)脆。工作中如有多臺冰凍機(jī)，可設(shè)置一臺溫度在-18度的專門切易脆的組織。冷凍組織時，隨時觀察，凍好就切，不要修的太深，脆的話稍復(fù)溫，一般都能解決。
