倪燦榮老師-免疫組化一抗的選擇及問題
免疫組化一抗的選擇及問題
抗體(antibody,Ab)是機體通過體液免疫，由B淋巴細胞活化、增殖、分化的漿細胞合成并分泌與刺激抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）。
02、抗體是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都具有抗體活性。兩者在概念上并不完全等同，抗體是生物學和功能上的命名，而Ig是結(jié)構(gòu)和化學本質(zhì)上的概念。
①由于無抗體活性的Ig一般很少見，故抗體與Ig可認作為同義詞。人類Ig有五類(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)是由分子結(jié)構(gòu)中相應(yīng)的重鏈（H鏈）的α.δ.ξ.γ和μ決定；重鏈不同，Ig的類型就不同。輕鏈（L鏈）則在同一抗體分子（Ig）中是相同的，或為κ，或為λ。若輕鏈不同表明該Ig和抗體是雜系、多克隆的；反之，輕鏈單一、同型則表示該Ig或抗體是單克隆的。
②Ig單體的基本結(jié)構(gòu)是由二條相同的輕鏈和二條相同的重鏈組成，各自鏈間（輕–重或重–重鏈）由二硫鍵（–S–S–）相連接，呈Y字構(gòu)型。
③Ig分子的氨基酸構(gòu)型可分為可變區(qū)（N-端）和恒定區(qū)（C-端）兩部分。
①Ig都是大分子蛋白質(zhì)，既具有免疫原性，又具有能與相應(yīng)抗原結(jié)合的抗體活性。
②免疫原性的類屬特異性是由Ig分子的重鏈和輕鏈恒定區(qū)特定的氨基酸序列所決定，抗體活性位點存在于Ig的可變區(qū)。
③Ig由B淋巴細胞衍生的漿細胞生成，主要以可溶性蛋白的形式存在于體液中。
④Ig的主要生物學功能有：特異性結(jié)合抗原、活化補體、結(jié)合Fc受體等。
⑤一個抗體（Ig）分子具有兩個結(jié)合位點（兩價）。
1.多克隆抗體(pAbs) 用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。
2.單克隆抗體(mAb)由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產(chǎn)生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應(yīng)性。
3. 基因工程抗體 。
06、噬菌體展示技術(shù)的主要特點是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。
單克隆抗體
多克隆抗體
特異性
較強
較弱
穩(wěn)定性
相對較差，對理化條件敏感
較好
對免疫原的要求
不純的免疫原也能得到高純度的抗體
免疫原純度越高越好
標準化
易于標準化，批次間差異小
較難，不同批次的抗體質(zhì)量差異大
識別
僅檢測抗原上的一個表位
能識別多個表位
交叉反應(yīng)
不易與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)
很常見，難避免非特異反應(yīng)
沉淀和凝集反應(yīng)
大多數(shù)沒有
有
制備成本
較高
較低
制備周期
較長
較短
價格
較高
較低
目前商品化抗體已有幾千種，一種抗體可以有數(shù)家公司生產(chǎn)，其質(zhì)量的好壞也存在很大差異(因生產(chǎn)技術(shù)、工藝及克隆號之間的差異)，首先應(yīng)選擇一家好的生產(chǎn)公司，根據(jù)文獻、質(zhì)控網(wǎng)站提供的信息，以及使用者的經(jīng)驗來選擇所需試劑的型號。具有:
1. 國家食品藥品安全監(jiān)督管理局（CFDA）和FDA批準的 伴隨診斷檢測試劑盒首選。
2. 經(jīng)NordiQC, UKNEQAS 等全球室間質(zhì)評評價為最好的抗體才會定義為優(yōu)質(zhì)抗體。
3.沒有達到最優(yōu)標準的抗體經(jīng)過持續(xù)改進和重新研發(fā)新克隆，并經(jīng)質(zhì)控驗證Ab1。
4.具有CFDA認證的優(yōu)先。
5.經(jīng)國內(nèi)各級質(zhì)控機構(gòu)室間質(zhì)評評價為最好的抗體優(yōu)先。
6.兔單抗(rmAb)優(yōu)先,其次是鼠單抗(mAb) 、兔多抗、鼠多抗等。
1.種屬：單克隆抗體，多克隆抗體
2.能否用于石蠟切片
3.稀釋度
4.特異性，交叉反應(yīng) 組織細胞定位
5. 用何種組織前處理方式(HIER/酶消化)
6. 包裝單位、價格(性價比)、貨號: 、產(chǎn)品號
7. 克隆號(很重要)
8. RTU/濃縮型
9.有效期及保存條件。
1. RTU的優(yōu)勢--方便 穩(wěn)定 質(zhì)量高。
2. RTU應(yīng)注意的問題
①RTU一抗需與實驗室的檢測平臺或檢測系統(tǒng)的敏感性相匹配,否則會出現(xiàn)假陽性/假陰性。
②有效期。
③實驗室保存條件要求高。
④不同批次RTU Ab1應(yīng)有預實驗/旨。
|
濃縮型一抗 |
Dako Auto/Omnis |
BenchMark XT /Ultra |
Leica Bond III / Max |
|
|
TRS pH 9.0 6.1 |
CC1 8.5 CC2 6.5 |
BERS2 pH 9.0 BERS1 6.1 |
|
pAb clone A0485 |
6/10(60%) 14/20(70%) |
14/20 - |
0/1 2/2 |
|
rmAbclone SP3 |
2/3 - |
2/5 - |
3/12 - |
1、克隆選擇不準確或與之相匹配的檢測方法(平臺)不一致。3+做成2+(HER2-FISH顯示信號擴增,比值=3.1-3.7)呈假陰性,占73%(33/46)。
2、假陽性染色結(jié)果(6/46)或信噪比低/形態(tài)學受損/技術(shù)問題(7/46)。
3.、FDA-/CE-IVD批準的HER2 IHC檢測途徑最為成功。
①一抗體濃度過低。
②mAb克隆4C4.9(Roche/Ventana)的RTU Ab1不成功。
③前處理不充分(溫度太低和/或加熱時間太短)蛋白質(zhì)溶前處理或表位HIER遺漏。
④無法解釋的技術(shù)問題。
闌尾為最佳的陽性和陰性組織對照：外周神經(jīng)的雪旺細胞，巨噬細胞/樹突細胞和脂肪細胞必須中度至強的不同程度的核和質(zhì)染色。在其他類型細胞，不得出現(xiàn)染色，包括闌尾固有層平滑肌細胞和柱狀上皮的肌肉細胞。此外，扁桃體也應(yīng)作為陽性對照。幾乎所有的濾泡間樹突細胞和鱗狀上皮的朗格漢斯細胞必須表現(xiàn)出中度至強烈的染色強度，濾泡樹突狀細胞(網(wǎng))必須至少顯示弱至中等但不同的核/細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
濃縮型Ab1
優(yōu)
良
級格
不級格
Suff1
Suff1OPS
mAb 4C4.9
0
3
4
0
43%
-
mAb 15E2E2
0
1
1
0
-
-
mAb15E2E2+4C4.9
0
1
0
0
-
-
pAb Z0311 DAKO
62
60
14
1
89%
97%
pAb NCL-LS100P
1
6
3
0
70%
100%
pAb RB-9018-P
0
0
1
0
-
-
pAb RP-035
0
0
1
0
-
-
末知名
0
1
0
0
-
-
RTU
mAb 4C4.9
0
26
18
0
56%
-
rmAb EP32
0
1
0
0
-
-
pAb IS/IR504
0
27
4
0
87%
-
pAb GA504
4
21
1
0
96%
-
pAb 760-2523
0
23
2
3
82%
-
pAb PA0900
0
6
0
0
100%
-
pAb E031
0
1
0
0
-
-
總計(%) 299
67(23%)
178(59%)
49(16%)
5(2%)
濃縮型一抗
pAb Z0311: HIER是關(guān)鍵(高pH值,偏堿)
pAb稀釋范圍1：1000-1：4000，這取決于IHC檢測的總靈敏度。
*(使用該緩沖液的最佳結(jié)果/實驗室數(shù)目)
濃縮Ab1
Dako Link 48
Dako Omnis
Ventana GX/XT/Ultr
Leica Bond III / Max
TRS pH9
TRS pH6
TRS pH9
TRS pH6.1
CC1 pH8.5
CC2pH6
Er2pH9
Er1pH6
pAb Z0311
6/11**
0/1
3/4
-
30/46
-
3/6
0/3
*上述所列的抗體濃度、各系統(tǒng)供應(yīng)商提供的緩沖液和檢測試劑盒。
**(使用該緩沖液的最佳結(jié)果/實驗室數(shù)目)
RTU系統(tǒng)
建議IHC染色設(shè)置*
實驗室修改的IHC染色設(shè)置*
優(yōu)
良
優(yōu)
良
Dako pAb IS/IR504
80%（8/10）
0%（0/10）
88%（14/16）
0%（0/16）
Dako Omnis pAb GA504
100%（15/15）
7%（1/15）
83%（5/6）
0%（0/6）
Leica BONDMAX/III
pAb PA0900
0%（0/0）
0%（0/0）
100%（6/6）
0%（0/6）
VMS Ultra/XTpAb 760-2523
100%（6/6）
0%（0/6）
77%（17/22）
0%（0/22）
VMS Ultra/XTmAb 4C4.9
33%（1/3）
0%（0/3）
58%（19/33）
0%（0/33）
*pAb,GA504,Dako,Omnis: 最佳結(jié)果的方案:TRS pH9.0(GV804),HIER 30分鐘。Ab1 97min和EnVisionFlex（GV800）17min。14/14（100%）實驗室產(chǎn)生了足夠的染色結(jié)果。
19、54%(160/299)的實驗室采用實驗室內(nèi)的濃縮抗體 (LD)對S100進行檢測。pAb Z0311是應(yīng)用最廣泛的抗體，可用于獲得表1和表3所示的最佳染色結(jié)果。在LD法中，pAb Z0311的總通過率為89%(122/137)，45%(62/137)為最佳。
1、80%-90%的扁桃體生發(fā)中心B-細胞亮區(qū)和暗區(qū)和絕大多數(shù)基底鱗狀上皮細胞中有中等至強的核染色反應(yīng)。
2、胰腺外分泌腺和導管上皮細胞可見散在的中等至強、明顯的核染色反應(yīng)。
3、乳腺癌中適當比例腫瘤細胞的一種中等至強、明顯的核染色反應(yīng)。
4、僅在肝細胞(<1%)有散在核染色反應(yīng)。
5、無或只有弱背景和細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
①HIER不充分 ②Ab1濃度過低 ③克隆選擇不當
22、mAb克隆：BS4、GM001、K2、MIB-1、UMAB107和rmA克隆：30-9和SP6全部適用于Ki67的可推薦Abs1。有效的HIER是必需的，以獲得最佳結(jié)果，并且必須被攜帶以提供靈敏度和保留形態(tài)之間的最佳平衡。
RTU克隆：MIB-1(DAKO)，和30-9(Ventana)，顯示出略高于實驗室開發(fā)的Ki67測試的通過率。
正常扁桃體是目前Ki67最值得推薦的陽性組織控制組織。80%-90%的生發(fā)中心B-細胞必須表現(xiàn)出中等至強的核反應(yīng).尤其是低水平的Ki67必須在亮區(qū)B細胞中表達。
濃縮抗體
優(yōu)
良
級格
不級格
Suff1
Suff/OPS2
mAb clone BS4
1
0
0
0
-
-
mAb clone GM001
1
0
0
0
-
-
mAb clone K2
2
1
0
0
-
-
mAb clone MIB-1
72
36
13
2
88%
90%
mAb clone UMAB107
2
4
1
0
86%
80%
rmAb clone SP6
17
5
1
0
96%
95
pAb RB-1510
1
0
0
0
-
-
RTU
優(yōu)
良
級格
不級格
Suff1
Suff/OPS2
mAb clone GM001 60-0040-7
1
0
0
0
-
-
mAb clone K2 PA0230
2
2
0
0
-
-
mAb clone Ki88 AM370
0
1
0
0
-
_
mAb MIB-1 IR626/IS626
34
25
5
1
91%
94%
mAb MIB-1 GA626
25
5
1
0
97%
100%
mAb clone MIB-1 AM297
1
0
0
0
-
-
mAb clone MX006 MAB-0672
0
8
1
0
-
-
rmAb clone SP6 275R
2
1
1
0
-
-
rmAb clone SP6 PRM 325
0
1
0
0
-
-
rmAb clone SP6 MAD-000310QD
0
1
0
0
rmAb clone 30.9 790-4286
121
9
1
0
-
總計(%) 299
67(69%)
178(24%)
49(6%)
5(1%)
93%
-
HIER:堿性 20-30min
|
濃縮Ab1 |
Dako平臺 |
Ventana平臺 |
Leica平臺 |
|||||||
|
|
TRS pH9.0 |
TRS pH6.1 |
CC1 pH8.5 |
CC2 pH6.0 |
ER2 pH9.0 |
ER1 pH9.0 |
||||
|
mAb clone MIB-1 |
16/20** |
2/2 |
39/61 |
- |
5/16 |
0/3 |
||||
**(使用該緩沖液的最佳結(jié)果/實驗室數(shù)目)
mAb克隆MIB-1和rmAb克隆SP6是應(yīng)用最廣泛的兩種單克隆抗體
63%（150/409個）實驗室使用了RTU抗體。使用不同平臺其通過率也不一致。
25、P40
①、定位：細胞核,是P63的亞型之一。肺鱗癌:90%表達+,p40與p63敏感性相當，特異性優(yōu)于p63;肺腺癌中幾乎不表達。可用于肺腺/鱗癌的鑒別診斷。
②、Clone#： BC28 、ZR8等。
③、陽性對照組織：肺鱗癌等。
④、HIER方式：EDTA pH9.0 。
⑤、IHC檢測系統(tǒng)的選擇。
1、幾乎所有扁桃體鱗狀上皮細胞和前列腺增生腺體襯里基底細胞的一種中等到強的明顯的核染色反應(yīng)。
2、胎盤中分散的滋養(yǎng)層細胞的一種至少弱到中、明顯的核染色反應(yīng)。
3、肺鱗狀細胞癌中絕大多數(shù)腫瘤細胞呈中等至強、明顯的核染色反應(yīng)。
4、肺腺癌中腫瘤細胞的無染色反應(yīng)。
5、扁桃體內(nèi)淋巴細胞等其他細胞的無染色反應(yīng)。
27、mAb克隆BC28和ZR8可獲得p40的最佳染色結(jié)果。mAb克隆株BC28是目前應(yīng)用最廣泛、最成功的p40抗體，對濃縮型和RTU型的通過率分別為86%和91% 。
|
濃縮型Ab1 |
優(yōu) |
良 |
級格 |
不級格 |
Suff1 |
Suff1OPS |
|
mAbclone BC28 |
52 |
24 |
10 |
2 |
86% |
89% |
|
rmAb clone ZR8 |
1 |
6 |
2 |
5 |
50% |
67% |
|
pAb AC13030 |
0 |
2 |
6 |
0 |
- |
- |
|
pAb RP163 |
0 |
1 |
1 |
3 |
- |
- |
|
pAb PC373 |
0 |
1 |
0 |
3 |
- |
- |
|
pAb RBK054 |
0 |
0 |
1 |
2 |
- |
- |
|
pAb PI049 |
0 |
0 |
1 |
0 |
- |
- |
|
濃縮Ab1 |
Dako Link 48 |
Dako Omnis |
VentanaBenchMark GX |
LeicaBond III / Max |
||||
|
|
TRS Ph9 |
TRS pH6.1 |
TRS pH9 |
TRS pH6.1 |
CC1 pH8.5 |
CC2 pH6 |
Er2 pH9 |
Er1 pH6 |
|
P40,BC28 |
7/20** 35% |
1/1 |
6/8 75% |
1/1 |
30/42 71% |
- |
3/6 50% |
0/1 |
|
RTU系統(tǒng) |
建議IHC染色流程* |
實驗室修改的IHC染色流程** |
||
|
|
足夠 |
最佳 |
足夠 |
最佳 |
|
DVMS Ultra/XT mAb BC28 790-4950 |
87%（13/15） |
40%（6/15） |
91%（21/23） |
57%（13/23） |
*供應(yīng)商vendor推薦的協(xié)議設(shè)置- HIER方法和持續(xù)時間、Ab1孵育時間、檢測工具包、IHC染色器/設(shè)備。
**重大修改：HIER方法、時間和Ab1孵育時間改變>25%。
30、對照
1. 胎盤被推薦作為p40的陽性組織對照，至少必須看到細胞滋養(yǎng)細胞的弱到中度，不同的核染色反應(yīng)。即使在低放大率(5倍目標)時，細胞滋養(yǎng)層細胞也應(yīng)該是可見的。
2. 扁桃體支持胎盤，可作為陽性或陰性組織對照。幾乎所有鱗狀上皮細胞都必須表現(xiàn)出中等至強烈的核染色反應(yīng)。在其他類型的細胞中不存在核或細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
評估Lu-ALK染色為最佳的標準包括：
1.間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)中幾乎所有腫瘤細胞的一種明顯的、中等到強的核和細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
2.伴EMl4-ALK易位肺腺癌中幾乎所有腫瘤細胞的至少弱到中度顆粒細胞質(zhì)染色。
3.默克爾細胞癌中幾乎所有腫瘤細胞的至少弱到中度顆粒細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
4.闌尾神經(jīng)節(jié)細胞和分散軸突的至少弱到中度顆粒細胞質(zhì)染色反應(yīng)。
5.無EMl4-ALK易位肺腺癌腫瘤細胞陰性。
6.闌尾和扁桃體上皮細胞陰性。
1、Ab1不太成功(克隆號選擇不準確)
2、Ab1濃度太低
3、使用IHC染色平臺靈敏度低的檢測系統(tǒng)
1、首推mAb OTI1A4 和 rmAb D5F3 伴EMl4-ALK易位肺腺癌檢測。 高pH HIER、使用敏感的3步聚合物/2步多聚體檢測系統(tǒng)。
2、其次是mAb 5A4,但與mAb OTI1A4和rmAb D5F3相比，靈敏度較低。
濃縮抗體
Dako
Autostainer
Link / Classic
Dako Omnis
Ventana BenchMark XT / Ultra
Leica Bond III / Max
TRS pH 9.0 6.1
TRS pH 9.0 6.1
8.5 6.0
9.0 6.0
mAb clone 5A4
2/8(25%) -
0/3 -
4/13(31%) -
2/5(40%) -
mAb clone OTI1A4 / 1A4
3/3
14/15(93%) -
1/2 -
1/2 -
rmAb clone D5F3
3/4
0/5 -
5/10(50%) -
2/8(25%) -
闌尾被發(fā)現(xiàn)是一種有價值和值得推薦的外部陽性組織對照，特別有助于評估分析靈敏度的水平;在幾乎所有的Lu-ALK最佳方案中，神經(jīng)節(jié)細胞中出現(xiàn)了弱到強的顆粒細胞質(zhì)染色反應(yīng)，軸突中出現(xiàn)了弱到中等的反應(yīng)。
IMT(炎性肌纖維母細胞腫瘤)由梭形肌纖維母細胞構(gòu)組成，間質(zhì)伴有炎癥細胞浸潤 D5F3（Ventana+BenchMark）：腫瘤細胞彌漫強染色，定位于胞質(zhì)。
37、小結(jié)
①、知道每種一抗的最低表達范圍。
②、需設(shè)哪幾種對照。
③、定位需要準確，可根據(jù)說明書提示，蛋白質(zhì)的生物學功能作出判斷。
④、可以用原位雜交的方法互相印證結(jié)果的可靠性。
⑤、了解每一種抗體的判斷標準。
注：建議配合視頻學習，效果更佳。
回放更新時間：6月27日，回放視頻觀看方式【關(guān)注“達科為醫(yī)療”公眾號，點擊達學堂菜單—課后回放進入學習】
病理·達學堂
2020.06.12
